純干貨！巧用外泌體示蹤，探索細(xì)胞通訊奧秘！
外泌體，作為細(xì)胞間通訊的重要載體，近年來(lái)在臨床醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)治療領(lǐng)域中引起了廣泛的關(guān)注。外泌體含有豐富的活性物質(zhì)，可以調(diào)控細(xì)胞間的信息交流，在藥載遞送、無(wú)細(xì)胞治療、疾病診斷方面具有潛在的技術(shù)應(yīng)用藍(lán)海。
目前可以通過(guò)差速離心、過(guò)濾、免疫親和、層析、流式細(xì)胞分選、密度梯度離心等多種手段大致分離出不同的細(xì)胞外囊泡亞群，再利用外泌體示蹤技術(shù)追蹤外泌體在體內(nèi)的分布和歸宿，以及它們與細(xì)胞的相互作用，在細(xì)胞治療領(lǐng)域中具有重要作用。
親脂性染料可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合，直接使用熒光染料（如PKH26、PKH67、DAPI、DiO等）標(biāo)記外泌體，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和分析外泌體，染色效果較好，是目前較為常見(jiàn)的示蹤方法。
圖1.染料標(biāo)記外泌體染色效果
通過(guò)將外泌體表面或內(nèi)部的核酸（如miRNA、siRNA等）標(biāo)記為熒光探針或放射性標(biāo)記物，利用核酸雜交或放射性測(cè)量等技術(shù)來(lái)追蹤外泌體的運(yùn)輸和內(nèi)部化過(guò)程。
利用特定的抗體或標(biāo)記蛋白（如GFP、Luciferase等）標(biāo)記外泌體表面的特定蛋白質(zhì)，通過(guò)免疫熒光染色或酶活性測(cè)量等方法來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，外泌體的特定蛋白 CD63 和綠色熒光蛋白 GFP 的表達(dá)元件構(gòu)建成質(zhì)粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細(xì)胞，使細(xì)胞分泌的外泌體帶有綠色熒光，如下圖2。
圖2.用 GFP 標(biāo)記的外泌體分別與 SH-SY5Y、BV2細(xì)胞共培養(yǎng)
利用磁性納米顆粒（如超順磁性鐵氧體顆粒）標(biāo)記外泌體，通過(guò)磁共振成像或磁力測(cè)量等技術(shù)來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化過(guò)程。
圖3.USPIO標(biāo)記外泌體的體內(nèi)核磁共振成像
使用放射性同位素（如99mTc、125I等）標(biāo)記外泌體，通過(guò)放射性測(cè)量技術(shù)（如放射性計(jì)數(shù)或正電子發(fā)射斷層掃描）來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，研究人員用鋯 89 ( 89 Zr)標(biāo)記GMP級(jí)別外泌體的定量生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)，如圖4。與熒光或生物發(fā)光成像相比，放射性核素成像因其對(duì)深部組織成像的出色靈敏度和定量測(cè)量的潛力而為生物分子治療的體內(nèi)跟蹤提供了多種優(yōu)勢(shì)。
圖4.89Zr標(biāo)記外泌體不同注射時(shí)間在小鼠和大鼠體內(nèi)的定量分布
